МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ
(МГС)
INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION
(ISC)
ГОСТ
31502-
2012
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ
СТАНДАРТ
МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ
Микробиологические методы определения наличия
антибиотиков
Издание официальное
Москва
Стандартинформ
2013
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0—92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 12—2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения. обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН Государственным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ 8НИМИ Россельхоэакадемии) и Государственным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхоэакадемии)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 24 мая 2012 г. No 41)
За принятие проголосовали:
|
Краткое наименование стран» по МК (ИСО Э1бв) 004-97 |
Код страны по МК (ИСО 31вв) 004-97 |
Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
|
Азербайджан |
А2 |
Аэстандарт |
|
Армения |
AM |
Минэкономики Республики Армения |
|
Кыргызстан |
КО |
Кыргызстандарт |
|
Молдова |
МО |
Молдоаа-Стандарт |
|
Российская Федерация |
RU |
Росстандарт |
|
Таджикистан |
TJ |
Таджикстандарт |
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 ноября 2012 г. No 730-ст межгосударственный стандарт введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.
5 Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 51600—2010
6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта публику-втся в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты».
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок— в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты»
€> Стандартинформ. 2013
в Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии
Содержание
in
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ Микробиологические методы определения наличия антибиотиков
Milk and milk products.
Microbiological methods of the determination of antfciotics
Дата введения — 2013—07—01
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на сырое, пастеризованное, стерилизованное и предварительно восстановленное сухое коровье молоко (далее — молоко) и устанавливает качественные микробиологические методы определения наличия антибиотиков:
• чашечный метод с Bacillus stearothermophilus;
• метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бромкрезоппурлур;
• метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бриллиантовый черный.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 12.1.005—68 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.007—76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 427—75 Линейки измерительные металлические. Технические условия ГОСТ 975—88 Глюкоза кристаллическая гидратная. Технические условия ГОСТ 975—88 Глюкоза кристаллическая гидратная. Технические условия ГОСТ 1770—74 (ИС01042—83. ИС0 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры. мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 2493—75 Реактивы. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия ГОСТ 3118—77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 3145—84 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условия ГОСТ 3622—68 Молоко и молочные продукты. Отбор проб и подготовка их к испытанию ГОСТ 4198—75 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия ГОСТ 4233—77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия ГОСТ 6709—72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ ISO 7218—2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям
ГОСТ 9285—78 (ИСО 992—75. ИСО 995—75. ИСО 2466—73) Калия гидрат окиси технический. Технические условия
ГОСТ 13805—76 Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей. Технические условия
ГОСТ 14919—83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 16317—87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
Издание официальное
ГОСТ 17206—96 Агар микробиологический. Технические условия
ГОСТ 19881—74 Анализаторы потенциометрические для контроля pH молока и молочных продуктов. Общие технические условия
ГОСТ 22649—83 Стерилизаторы воздушные медицинские. Общие технические условия
ГОСТ 23454—79 Молоко. Методы определения ингибирующих веществ
ГОСТ 24065—80 Молоко. Методы определения соды
ГОСТ 24066—80 Молоко. Метод определения аммиака
ГОСТ 24067—80 Молоко. Метод определения перекиси водорода
ГОСТ 24104—2001 Весы лабораторные. Общие технические требования
ГОСТ 25336—82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 26668—85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов
ГОСТ 2S669—85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов
ГОСТ 26809—86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу
ГОСТ 29227—91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настояыщим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандвртом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в чести, не затрагивающей оту ссылку.
3 Оборудование, средства измерений, посуда, материалы и реактивы
3.1 Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания ± 0,0002 г.
3.2 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317. поддерживающий температуру от 0 *С до 12 *С.
3.3 Центрифуга с частотой вращения 3000 мин-‘ и разделяющим фактором 750 м/с2.
3.4 Пробирки центрифужные термостойкие вместимостью 25 см3 по ГОСТ 1770.
3.5 Термостат или блок термостатированных ячеек, поддерживающий температуру от 30 *С до 70 вС с допустимой погрешностью ± 0.5 *С.
3.6 Баня водяная с терморегулятором, поддерживающая температуру от 60 °С до 90 *С.
3.7 Анализатор потенциометрический ло ГОСТ 19881 2-гоклассаточностидиапаэономизмерений от 5.5 до 8.0 ед. pH.
3.8 Сепаратор-сливкоотделитель.
3.9 Шкаф сушильный, поддерживающий температуру (160 ± 5) *С.
3.10 Автоклав, поддерживающий температуру (12112) ®С.
3.11 Стерилизатор воздушный медицинский по ГОСТ 22649 или стерилизатор паровой медицинский. поддерживающий температуру (121 ± 2) ®С.
3.12 Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919.
3.13 Микроскоп световой биологический.
3.14 Пробойник диаметром 10 мм или сверло пробочное № 4.
3.15 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.
3.16 Линейка ло ГОСТ 427 с пределом измерения 150 мм.
3.17 Аппарат «Микрофот 5ПО-1» или другой проекционный аппарат.
3.18 Колбы конические ло ГОСТ 25336 вместимостью 25.100. 250 см3.
3.19 Колбы мерные по ГОСТ 1770 вместимостью 200 и 1000 см3.
3.20 Пробирки по ГОСТ 1770 вместимостью 10 см3.
3.21 Чашка Петри по ГОСТ 25336.
3.22 Пипетки градуированные 2-го класса точности ло ГОСТ 29227 вместимостью 5.10 и 25 см3.
3.23 Пипетки, отмеряющие объем 0,05 и 0.1 см3.
3.24 Шприц-дозатор автоматический вместимостью 0.1 см3 или шприц-дозатор автоматический вместимостью 1.0 см3, настроенный на объем пробы 0.1 см3.
3.25 Наконечники пластмассовые одноразовые вместимостью 0.1 см3.
3.26 Пинцет.
3.27 Гидролизат кормовых дрожжей.
3.28 Эталон стандартный мутности по нормативным документам государства, принявшего стандарт.
3.29 Препарат сухой для контроля определения ингибирующих веществ в молоке (СКИВ) по нормативным документам государства, принявшего стандарт.
3.30 Образец стандартный стрептомицина по нормативным документам государства, принявшего стандарт.
3.31 Фуксин основной для микробиологических целей, спиртовой раствор массовой концентрации 0,05 г/см3 по нормативным документам государства, принявшего стандарт.
3.32 Экстракт дрожжевой.
3.33 Глюкоза по ГОСТ 975.
3.34 Пептон сухой ферментированный для бактериологических целей по ГОСТ 13805.
3.35 Агар микробиологический по ГОСТ 17206.
3.36 Натрий хлористый по ГОСТ 4233.
3.37 Калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198.
3.38 Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный по ГОСТ 2493.
3.39 Калия гидрат окиси по ГОСТ 9285. раствор массовой концентрации 0,056 г/см3.
3.40 Кислота соляная по ГОСТ 3118. раствор массовой концентрации 0.0365 г/см3.
3.41 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
3.42 Тест-культура Ne 1 (тест-культура Bacillus stearothermophilus ВКМВ—510)°— тест-культура Bacillus stearothermophilus.
3.43 Среда № 1 (среда агаровая питательная табпетированная «Delvotest SP»)2*— питательная таблетированная среда, упакованная в бутылочки из темного стекла с навинчивающимся колпачком, капсулой силикагеля и поролоновым уплотнителем.
3.44 Среда № 2 (агаровая среда «Delvotest’ SP»)3» — агаровая среда, содержащая споры Bacillus stearothermophilus various calidoiactis и индикатор бромкреэолпурпур. герметично укупоренная в ампулы вместимостью 1.0 см3, собранные в блоки.
3.45 Среда Ne 3 (среда «Delvotest’ SP-NT» или «Delvotest1 SP MINI—NT»)*>— смесь агаровой и питательной сред, содержащая споры Bacillus stearothermophilus various calidoiactis и индикатор бромкреэолпурпур, герметично укупоренная в ампулы вместимостью 1.0 см3, собранные в блоки.
3.46 Тест-набор № 1 (тест-набор «BRT Inhibitor Test»)51, включающий: герметично укупоренные пробирки или пластины с агаровой и питательной средой, содержащей споры Bacillus stearothermophilus various calidoiactis и индикатор бриллиантовый черный: самоклеящуюся ленту для пластин; контрольный раствор молока с пенициллином G массовой концентрацией 0.004 мкг/г и контрольный раствор молока без антибиотиков.
” Тест-культура Bacilus stearothermophilus 8КМВ-510, выпускаемая Институтом биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН.
21 Среда является рекомендуемой к применению. Эта информация приведена для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение указанной среды. Допускаются к использованию среды производства других изготовителей, предназначенные для целей описываемых методов. Рекомендована питательная среда «Oelvotesf* SP» {ООО «ДСМ Восточная Европа»).
31 Среда является рекомендуемой к применению. Эта информация приведена для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение указанной среды. Допускаются к использованию среды производства других изготовителей, предназначенные для целей описываемых методов. Рекомендована агаровая среда «Delvotest* SP* (ООО «ДСМ Восточная Европа»}.
41 Среда является рекомендуемой к применению. Этв информация приведена для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение указанной среды. Допускаются к использованию среды производства других изготовителей, предназначенные для целей описываемых методов. Рекомендованы среды «Delvotest’ SP-NT» и «Delvotest’ SP MINI-NT* (ООО «ДСМ Восточная Европа»).
ч Тест-набор является рекомендуемым к применению. Этв информация приведена для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавлвиает обязательное применение указанного тест-набора. Допускаются к использованию тест-наборы производства других изготовителей, предназначенные для целей описываемых методов. Рекомендован тест-набор «BRT inhibitor Test* (ООО «Хр. Хансен»).
Применение конкретных видов оборудования, средств измерений, материалов и реактивов — в соответствии с требованиями разделов 4 и 5.
Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.
4 Отбор и подготовка проб
Отбор и подготовка проб — по ГОСТ 3622. ГОСТ 26668. ГОСТ 26669. ГОСТ 26609 с дополнением. До-пусхается хранить подготовленные пробы молока в холодильнике при температуре (5 ± 1) ®С не белее 24 ч.
5 Методы контроля
5.1 Чашечный метод с Bacillus stearothermophilus
Метод основан на способности антибиотиков, содержащихся в молоке, диффундировать в агаровую среду со спорами Bacillus stearothermophilus и препятствовать их росту, что приводит к образованию прозрачных зон ингибиции. Наличие антибиотиков в молоке устанавливают по размеру диаметра зоны ингибиции.
5.1.1 Подготовка к определению
5.1.1.1 Подготовка лабораторной посуды — по ГОСТ ISO 7218.
5.1.1.2 Приготовление сред
Питательная среда: в мерной колбе по ГОСТ 1770 вместимостью 1000 см3 в небольшом количестве дистиллированной воды по ГОСТ 6709 растворяют 10.0 г дрожжевого экстракта по 3.32.20.0 г пептона по ГОСТ 13805. 0.5 г глюкозы по ГОСТ 975. доводят объем раствора дистиллированной водой до метки и потенциометрическим анализатором по 3.7 устанавливают активность питательной среды (7,1 ± 0,1) ед. pH. Затем в необходимое количество конических колб по ГОСТ 25336 вместимостью 250 см3 наливают по 200 см3 приготовленной питательной среды и стерилизуют в стерилизаторе по 3.11 при температуре (121 ± 2) вС в течение (1511) мин.
Срок хранения питательной среды в холодильнике при температуре (5 ± 1) вС — не более 1 мес.
Агаровая среда: в мерную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 200 см3 вносят 100 см3 дистиллированной воды. 1,0 г гидролизата кормовых дрожжей, 0,4 г пептона. 0,1 г хлористого натрия по ГОСТ 4233 и 1.6 г микробиологического агара по ГОСТ 17206. перемешивают до полного растворения и нагревают на электроплитке до кипения. Затем агаровую среду охлаждают до температуры (5515) вС. устанавливают активность агаровой среды (7.3 ±0.1) ед. pH и стерилизуют при температуре (121 ± 2) вС в течение (15 ± 1) мин.
Срок хранения агаровой среды в холодильнике при температуре (5 ± 1) вС — не более 1 мес.
Допускается применять среды промышленного изготовления, аналогичные указанным выше.
5.1.1.3 Получение спор тест-культуры
Питательную среду, подготовленную по 5.1.1.2, засеивают 2—3 см3 тест-культуры Ne 1 по 3.42, выращенной в пробирках с этой же средой в течение 18—20 ч. тщательно перемешивают, помещают в термостат и нагревают при температуре (55 ± 1) *С в течение 3 сут.
После окончания инкубации иэ посевов берут мазки, окрашивают их спиртовым раствором основного фуксина по 3.31 массовой концентрации 50 г/дм3 и микросхопируют. При наличии в колбах с посевами 90 % — 95 % свободных сформировавшихся спор колбы помещают в холодильник на 16—18 ч для осаждения спор. Образовавшуюся надосадочную жидкость из колб сливают, а оставшийся осадок распределяют по стерильным центрифужным пробиркам и прогревают на водяной бане при температуре (67 i 2) *С в течение (30 ± 1) мин. После этого пробирки помещают на центрифугу по 3.3 и центрифугируют в течение 20—30 мин. Полученный осадок в каждой пробирке промывают дистиллированной водой (не менее трех раз) до получения прозрачной жидкости над ним.
Взвесь спор повторно нагревают при температуре (67 ± 2) вС в течение (30 ± 1) мин и переносят в пробирки.
Срок хранения спор тест-культур в холодильнике при температуре (5 ± 1) *С — не более 2 мес.
5.1.1.4 Приготовление засеянной агаровой среды
В пробирки отбирают взвесь спор тест-культуры, подготовленной по 5.1.1.3, и разводят дистиллированной водой до получения суспензии спор, визуально соответствующей 10 единицам по стандартному эталону мутности.
К100 см3 расплавленной и охлажденной до температуры (6012) *С агаровой среды, подготовленной по 5.1.1.2. добавляют 2.5 см3 40 %-ного водного раствора глюкозы и 4 см3 суспензии спор, подготовленной. как указано выше. Смесь агаровой среды и суспензии спор тщательно перемешивают и градуированной пипеткой разливают по (11 * 1) см3 в подготовленные для определения чашки Петри по ГОСТ 25336. установленные на горизонтальной поверхности.
Чашки Петри с засеянной смесью агаровой среды и суспензии спор допускается хранить в холодильнике при температуре (5 ± 1) вС не более 2 сут. Перед проведением определения чашки Петри прогревают в термостате при температуре (55 ± 1) *С в течение (20 ± 1) мин.
5.1.1.5 Подготовка проб и приготовление обезжиренного стерильного молока
а) Подготовка проб
Определению на наличие антибиотиков подлежат пробы молока, давшие положительный результат по ГОСТ 23454 и отрицательный — по ГОСТ 24065. ГОСТ 24066. ГОСТ 24067.8 стерильные пробирки пипеткой по ГОСТ 29227 отбирают по 5—10 см3 анализируемой пробы молока, нагревают на водяной бане при температуре (87 ± 2) *С в течение (10 ± 1) мин и охлаждают в холодной воде до температуры 18 вС — 25 -С.
б) Приготовление обезжиренного стерильного молока
Обезжиренное стерильное молоко получают из молока, предварительно проверенного на отсутствие ингибирующих веществ по ГОСТ 23454. с кислотностью 16—18 °Т с применением сепаратора-сливкоотделителя. Обезжиренное молоко разливают в пробирки по 10 см3 и стерилизуют при 101 кПа (1 атм) в течение (ЮН) мин.
5.1.1.6 Приготовление контрольного раствора стрептомицина
Контрольный раствор стрептомицина используют для проверки активности роста спор тест-культуры.
а) Приготовление фосфатных буферных растворов 1 и 2
Раствор 1: в мерной колбе вместимостью 1000 см3 в небольшом количестве дистиллированной воды растворяют 2.0 г деузамещенного фосфорнокислого калия по ГОСТ 2493 и 8.0 г одноэамешенного фосфорнокислого калия по ГОСТ 4198 и доводят объем дистиллированной водой до метки. Устанавливают pH раствора (6.1 ±0.1 )ед. pH с помощью растворов гидрата окиси калия по 3.39 или соляной кислоты по 3.40.
Раствор 2: в мерной колбе вместимостью 1000 см3 в небольшом количестве дистиллированной воды растворяют 16,73 г деузамещенного фосфорнокислого калия и 0.523 г однозамещенного фосфорнокислого калия и доводят объем дистиллированной водой до метки. Устанавливают pH раствора (7.9 ± 0.1) ед. pH с помощью растворов гидрата окиси калия или соляной кислоты.
Растворы стерилизуют при температуре (112 ± 2) *С в течение (30 ± 1) мин.
Срок хранения растворов в холодильнике при температуре (5 ± 1) *С — не более 30 сут.
б) Приготовление основного раствора стрептомицина массовой концентрации 500 мкг/см3
(5 ± 1) мг стрептомицина растворяют в конической колбе вместимостью 25 см3 в фосфатном буферном растворе 1. Соотношение фактического значения массовой концентрации стрептомицина к объему буферного раствора 1 должно быть 1:100.
Пример — Пои массовой концентрации стандарта стрептомицина 760 мкг/см3 5 мг антибиотика (5 ме) растворяют в 7.6 ем* буферного раствора 1. получив основной рествор массовой концентрации 500 мкг/см3.
Срок хранения основного раствора стрептомицина в посуде из темного стекла с притертой пробкой при температуре (5 ± 1) ®С — не более 30 сут.
в) Приготовление контрольного раствора стрептомицина массовой концентрации 2.5 мкг/см3
Подготавливают три стерильные пробирки вместимостью 10 см3. В первую пробирку наливают
1 см3 фосфатного буферного раствора 2 и 1 см3 основного раствора стрептомицина, во вторую — 9 см3 фосфатного буферного раствора 2 и 1 см3 раствора из первой пробирки, в третью — 9 см3 стерильного обезжиренного молока no 5.1.1.5. б и 1 см3 раствора из второй пробирки.
Массовая концентрация стрептомицина в разведениях составляет соответственно 250; 25 и 2.5 мкг/см3 соответственно. Третье разведение массовой концентрации 2,5 мкг/см3 является контрольным раствором.
Срок хранения контрольного раствора стрептомицина — не более 12 ч.
Допускается вместо контрольного раствора стрептомицина использовать предварительно восстановленный по ГОСТ 23454 (аналогично) препарат СКИВ по 3.29.
5.1.2 Проведение определения
5.1.2.1 На поверхности агаровой среды, разлитой в чашки Петри по 5.1.1.4. пробойником по 3.14 или пробочным сверлом вырезают семь лунок диаметром 10 мм (см. рисунок 1). Шесть лунок располагают по окружности чашки на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 28 мм их центров от центра чашки. Седьмую лунку вырезают в центре чашки в случае использования контрольного раствора стрептомицина.
Рисунок 1 — Схеме расположений лунок
5.1.2.2 В шесть лунок, расположенных по окружности чашки, лилеткой по 3.23 вносят по 0.05 см3 анализируемого молока, подготовленного по 5.1.1.5. а. В центральную лунку вносят 0.05 см3 контрольного раствора стрептомицина.
5.1.2.3 Чашки Петри выдерживают при комнатной температуре в течение 20 мин. затем их помещают в термостат крышками вверх и инкубируют при температуре (55 ± 1) ®С в течение 4 ч. Чашки в термостате размещают в один ряд.
5.1.3 Обработка результатов
5.1.3.1 Результаты определения оценивают непосредственно после инкубирования по 5.1.2.3. просматривая чашки Петри в проходящем свете от любого источника света.
Диаметры зон ингибиции роста тест-культуры, образуемых при взаимодействии с антибиотиками в пробах анализируемого молока и контрольным раствором стрептомицина, измеряют линейкой или на аппарате «Микрофот 5ПО-1» по краям окружностей зон.
5.1.3.2 При отсутствии зон ингибиции контрольного раствора стрептомицина (центральная лунка) определение повторяют.
5.1.3.3 Зона ингибиции диаметром 12 мм и более свидетельствует о присутствии антибиотиков в анализируемой пробе молока.
Зона ингибиции диаметром не более 12 мм или ее отсутствие свидетельствует об отсутствии антибиотиков в анализируемой пробе.
5.2 Метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бромкрезолпурпур
Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Bacillus stearothermophilus various calidoiactis C953 от фиолетовой до желтой — при отсутствии в анализируемом молоке антибиотиков и сохранении фиолетовой окраски — при наличии антибиотиков.
5.2.1 Подготовка к определению
5.2.1.1 Подготовка бутылочек со средой № 1
Стеклянную бутылочку со средой № 1 по 3.43 вынимают из холодильника и выдерживают в течение 20 мин при температуре (20 15) *С.
Открывают бутылочку, колпачок помещают на стол вниз донышком.
Пинцетом вынимают капсулу с силикагелем и поролоновый уплотнитель. Насыпают в колпачок необходимое количество таблеток питательной среды. Поролоновый уплотнитель и капсулу с силикагелем помещают в бутылочку.
5.2.1.2 Подготовка ампул со средами № 2 и 3
Осторожно, не повреждая упаковки, отрезают необходимое число ампул от блока со средой No 2 по 3.44 или средой Ne 3 по 3.45 и маркируют их. Оставшиеся ампулы в упаковке хранят в холодильнике при температуре (5 ± 1) ®С.
Соединительной частью шприца-дозатора по 3.24 прокалывают укупорочный материал ампул со средами No 2 или 3. В каждую открытую ампулу со средой No 2 пинцетом помещают по одной таблетке среды No 1 по 5.2.1.1. Затем бутылочку с таблетироеанной питательной средой по 5.2.1.1 плотно закрывают колпачком и хранят при температуре (20 ± 2) °С.
5.2.2 Проведение определения
5.2.2.1 В каждую ампулу по 5.2.1.2 шприцем-дозатором вносят по 0.1 см3 анализируемого молока, используя каждый раз новый наконечник. Оставшиеся анализируемые пробы хранят в холодильнике при температуре (5 ± 1) вС до окончания определения.
Ампулы помещают в термостат и выдерживают при температуре (64.0 ± 0.5) *С в течение 3 ч.
5.2.22 Контрольное определение проводят в соответствии с 5.2.2.1. В ампулу вносят 0.1 см3 предварительно восстановленного по ГОСТ 23454 препарата СКИВ.
5.2.3 Обработка результатов
5.2.3.1 Ампулы извлекают из термостата и определяют цвет содержимого анализируемого молока.
5.2.3.2 Желтый цвет содержимого ампул с анализируемыми пробами молока свидетельствует об отсутствии е нем антибиотиков. Фиолетовое кольцо, образовавшееся на поверхности содержимого ампул (диаметром не более 1 мм), не учитывают.
5.2.3.3 Фиолетовый цвет содержимого ампул с контрольной пробой и анализируемыми пробами молока свидетельствует о наличии антибиотиков
5.3 Метод с Bacillus stearothermophllus и индикатором бриллиантовый черный
Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Bacillus stearothermophllus various calidotactis от синей до желтой — при отсутствии в анализируемом молоке антибиотиков и других ингибирующих веществ и сохранении синей окраски — при наличии антибиотиков.
5.3.1 Подготовка к определению
Отрезают необходимое число полосок от тестовых пластин тест-набора Na 1 по 3.46 или берут требуемое количество пластин или пробирок тест-набора № 1. Удаляют запаянную фольгу с тестовых полосок и пластин или откупоривают пробирки. Оставшиеся пластины или пробирки хранят в холодильнике при температуре (5 ± 1) *С.
5.3.2 Проведение определения
5.3.2.1 При использовании пластин или полосок в одну из ячеек каждой пластины или полоски одноразовой пипеткой вносят 0.1 см3 контрольного раствора молока без антибиотиков по 3.46. в другую ячейку — 0.1 см3 контрольного раствора молока с пенициллином G. в остальные ячейки пластины или полоски вносят по 0.1 см3 анализируемого молока в двукратной повторности.
5.3.2.2 При использовании пробирок в одну пробирку одноразовой пипеткой вносят 0.1 см3 контрольного раствора молока без антибиотиков, в другую — 0.1 см3 контрольного раствора молока с пенициллином G. в остальные пробирки одноразовой пипеткой вносят по 0.1 см3 анализируемого молока в двукратной повторности.
5.3.2.3 Тестовые пластины и полоски заклеивают самоклеящейся лентой по 3.46. пробирки закупоривают и помещают в блок термостатированных ячеек по 3.5 или на водяную баню по 3.6 при температуре (65.0 10.5) °С и выдерживают до тех пор. пока содержимое на дне ячейки тестовых пластин или полосок, или пробирки с контрольным раствором молока без антибиотиков не окрасится полностью в желтый цвет в течение (135115) мин.
5.3.3 Обработка результатов
5.3.3.1 Пробирки, тестовые пластины или тестовые полоски извлекают из блока термостатируе-мых ячеек или водяной бани и определяют цвет содержимого на дне. не нарушая их целостности.
5.3.3.2 Желтый цвет содержимого пробирок или ячеек тестовых полосок или пластин с контрольным раствором и анализируемыми пробами молока свидетельствует об отсутствии в нем антибиотиков.
5.3.3.3 Синий цвет содержимого пробирок или ячеек тестовых полосок или пластин с контрольным раствором и анализируемыми пробами молока свидетельствует о наличии в нем антибиотиков.
6 Метрологические характеристики
Наименьшие пределы определения антибиотиков в молоке приведены в таблице 1.
Таблица 1
£д/г (ыкг/г)’
|
Наименование антибиотика |
Наименьший предел определения |
||
|
Чашечный метод с Bacillus stearolhermophilus |
Метод с Bacillus stearolhermophilus и индикатором бромхреэолпурпур |
Метод с BaciHus stearolhermophilus и индикатором бриллиантовый черный |
|
|
АМОКСИЦИЛЛИН |
— |
0.003 |
0.002 |
|
Ампициллин |
— |
0.003 |
0.002 |
|
Бензилленициллин |
0.005 |
0.0025 |
0.002 |
Окончание таблицы 1
Ёд/r (мкг/г)*
|
Наименьший предел определение |
|||
|
Наименование антибиотика |
Чашечный метод с ввели» steaieltiermophrius |
Метод с Bacillus slearothermophilus и индикатором бром «ремл пурпур |
Метод с Bacillus stearolhermophilus и индикатором бриллиантовый черный |
|
Гентамицин |
— |
0.4 |
0.2 |
|
Дигидрострептомицин |
— |
2.5 |
1.0 |
|
Диклоксациллин |
— |
0.01 |
0.01 |
|
Клоксациллин |
— |
0.02 |
0.02 |
|
Линкомицин |
— |
0.3 |
0.15 |
|
Мономициин |
0.25 |
— |
— |
|
Кафциллин |
— |
0.01 |
0.01 |
|
Неомицин |
0.25 |
0.4 |
0.5 |
|
Оксациллин |
— |
0.01 |
0.01 |
|
Окситетрациклин |
0.1 |
0.4 |
0.5 |
|
Олеаидомиции |
2.5 |
— |
— |
|
Пиперациллин |
— |
— |
0.01 |
|
Слирамицин |
— |
— |
0.4 |
|
Стрептомицин |
0.5—1.0 |
— |
— |
|
Сульфадиазин |
— |
— |
0.5 |
|
Сульфадиметохсин |
— |
— |
0.5 |
|
Сульфаметазин |
— |
— |
0.5 |
|
Сульфатиозол |
— |
— |
0.2 |
|
Тетрациклин |
0.1 |
0.3 |
0.2 |
|
Тилозин |
— |
0.1 |
0.025 |
|
Хлорамфеникол (лееомицетин) |
2.5 |
7.5 |
5.0 |
|
Хлортетрациклин |
0.05 |
0.3 |
— |
|
Цефазолин |
— |
— |
0.01 |
|
Цефалексин |
— |
0.08 |
0.2 |
|
Цефалониум |
— |
0.015 |
0.01 |
|
Цефаперазон |
— |
0.08 |
0.025 |
|
Цефапирин |
— |
0.005 |
0.004 |
|
Цефацетрил |
— |
0.02 |
— |
|
Цефкуином |
— |
— |
0.1 |
|
Цефтиофур |
— |
— |
0.05 |
|
Цефуроксим |
— |
— |
0.2 |
|
Эритромицин |
0.05 |
— |
0.04 |
|
* 1 мкг активного вещества равен 1 £д. активности. |
7 Требования безопасности
При работе с химическими реактивами следует соблюдать требования безопасности, установлен* ные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005 и ГОСТ 12.1.007.
Работу со споровой тест-культурой в лаборатории проводят в соответствии с установленными санитарными правилами, действующими на территории государства, принявшего стандарт.
УДК 637.11:543.06:006.354 МКС 67.100.10 Н19
Ключевые слова: молоко и молочные продукты, чашечный метод с Bacillus stearothermophilus. метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бромкрезолпурлур. метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бриллиантовый черный, метрологические характеристики, требования безопасности
Редактор е.В. Накупана Технический редактор Н.С. Гришаиоеа Корректор И.А. Королева Компьютерная верстка 8.И. Грищенко
Сдано а набор 12.04-2013. Подписано в печать 13.06 2013. Формат 90-84’/«. Гарнитура Ариал. Уел. печ. л. 1.86.
Уч.-иэд. л. 1.25. Тираж 153 экз Зак. 496.
«ГУП «СТАНДАРТИНФОРМ*. 123995 Москва. Гранатный пер.. 4. in ( Набрано во на ПЭВМ.
Отпечатано а филиале — тип. «Московский печатник», 105052 Москва. Лялин пер., 9.
Изменение № 1 ГОСТ 31502—2012 Молоко и молочные продукты. Микробиологические методы определения наличия антибиотиков
Принято Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол Ыв 70-П от 30.09.2014)
Зарегистрировано Бюро по стандартам МГС № 9808
За принятие изменения проголосовали национальные органы по стандартизации следующих государств: AM. А2. BY. MD. RU. TJ. UA (коды альфа-2 по МК (ИСО 3166) 004)
Дату введения в действие настоящего изменения устанавливают указанные национальные органы по стандартизации’
Раздел 2 дополнить ссылкой и сноской: «ГОСТ ISO 707—2013 Молоко и молочные продукты. Руководство по отбору проб
* Не действует на территории Российской Федерации».
Исключить повтор ссылки: ГОСТ 975—88 и наименование.
Раздел 3. Пункты 3.42—3.46 изложить в новой редакции, дополнить пунктами 3.47.3.48:
«3.42 Тест-культура No 1′1 — тест-культура Bacillus stearothermophilus.
3.43 Тест-набор № 1. включающий: пластины из герметично укупоренных ампул, содержащих смесь агаровой и питательной сред, споры Bacillus stearothermophilus various calidolactis и индикатор бромкре-золпурлур: клейкую ленту (для пластин).
3.44 Тест-набор No 2’. включающий: герметично укупоренные фольгой и содержащие смесь агаровой и питательной сред со спорами Bacillus stearothermophilus various calidolactis и индикатором бромкре-золпурпур пластины микропробирок или собранные рамкой в блоки ампулы вместимостью 1.0 смэ; одноразовые пипетки вместимостью 0.1 см3; клейкую ленту (для пластин).
3.45 Тест-набор N9 З31. по составу соответствующий указанному в п. 3.44.
3.46 Тест-набор N9 441. по составу соответствующий указанному в п. 3.44.
3.47 Тест-набор N9 5s’. включающий: пластины герметично укупоренных фольгой микропробирок, содержащих смесь агаровой и питательной сред со спорами Bacillus stearothermophilus various calidolac&s и индикатором бромкреэолпурпур: одноразовые пипетки вместимостью 0,1 см5; клейкую ленту (для пластин).
3.48 Тест-набор N9 6. включающий герметично укупоренные пробирки, полоски или пластины со смесью агаровой и питательной сред, содержащей споры Baailus stearothermophilus various calidolactis и индикатор бриллиантовый черный; самоклеящуюся ленту для пластин; контрольный раствор молока с Пенициллином G массовой концентрацией 0.004 мкг/г и контрольный раствор молока без антибиотиков.
Тест-культура Bacillus stearothermopMus various calidolactis ВКМБ-510. выпускаемая Институтом биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН.
2> Тест-наборы «Deivotest SP-NT. «Deivotest SP MINI-NT».
э> Тест-набор «Deivotest Т».
4} Тест-набор «Deivotest T-ST.
5> Тест-набор «Deivotest T-ST-OA.
Сноски ’> — 51 с указанными тест-культурой и тест-наборами являются рекомендуемыми к применению. Эта информащтя приведена для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает их обязатегъное применение. Допускаются к использованию тест-культуры и тест-наборы производства других изготовителей, обеспечивающие требования настоящего стандарта. В этом случае следует руководствоваться инструкциям, прилагаемыми к данным тест-наборам и тест-культуре».
Раздел 4 после слов «подготовка проб — по» дополнить ссылкой: «ГОСТ ISO 707».
Пункт 5.2.1. подпункты 5.2.1.1.5.2.1.2 изложить в новой редакции:
«5.2.1 Подготовка к определению
Термостат или водяную баню нагревают до температуры (64 ± 1) *С.
5.2.1.1 Подготовка тест-набора № 1
Необходимое количество ампул отрезают от пластины по 3.43. маркируют их и выдерживают при температуре (20 ± 2) вС. Оставшиеся ампулы в упаковке хранят в холодильнике при температуре (6 ± 2) *С с учетом срока годности.
Открывают ампулы, проколов фольгу с помощью шприца или ножниц.
5.2.1.2 Подготовка тест-наборов N9 2. № 3, No 4 и № 5
При использовании тест-наборов с пластинами микропробирок необходимое количество микропроби-рок отрезают от пластины ножницами или ножом и выдерживают при температуре (20 ± 2) *С. Открывают микропробирки, полностью удаляя фольгу, и маркируют их. Оставшиеся пластины в упаковке хранят в холодильнике при температуре (6 ± 2) вС с учетом срока годности.
При использовании тест-наборов с блоками ампул необходимое количество ампул достают из рамки, маркируют и выдерживают при температуре (20 ± 2) *С. Открывают ампулы, проколов фольгу с помощью острого угла рамки или ножниц. Оставшиеся ампулы в упаковке хранят в холодильнике при температуре (6 ± 2) *С с учетом срока годности».
Подпункты 5.2.2.1,5.2.2.2 изложить в новой редакции: дополнить подпунктом 5.2.2.3:
«5.2.2.1 Проведение определения с использованием тест-набора No 1
В каждую ампулу по 52.1.1 пипеткой вносят 0.1 см3 анализируемого молока, используя каждый раз новую пипетку. Оставшиеся анализируемые пробы хранят в холодильнике при температуре (6 ± 2) *С до окончания определения.
Ампулы заклеивают клейкой лентой по 3.43. помещают в термостат или на водяную баню и выдерживают при температуре (65 ± 2) *С в течение 3 ч.
52.2.2 Проведение определения с использованием тест-наборов №2. Np3, No4h№5
При использовании тест-наборов с пластинами микропробирок в каждую микропробирку по 5.2.1.2 пипеткой по 3.44 вносят 0.1 смэ анализируемого молока, используя каждый раз новую пипетку. После отбора пробы пипеткой избыток молока попадает в специальный резервуар на пипетке. Если этого не произошло —отбор пробы молока повторяют. Оставшиеся анализируемые пробы хранят в холодильнике при температуре (6 ± 2) *С до окончания определения.
Пластину с ыикропробирками заклеивают клейкой лентой, помещают в термостат или на водяную баню и выдерживают при температуре (64 ± 2) *С в течение 3 ч (при использовании тест-набора No 4 — 4 ч).
При использовании тест-набооов с блоками ампул в каждую ампулу по 5.2.1.2 пипеткой по 3.44 вносят 0.1 си3 анализируемого молока, используя каждый раз новую пипетку. После отбора пробы пипеткой избыток молока попадает в специальный резервуар на пипетке. Если этого не произошло — отбор пробы молока повторяют. Оставшиеся анализируемые пробы хранят в холодильнике при температуре (612) *С до окончания определения.
Ампулы помещают в термостат или на водяную баню и выдерживают при температуре (64 ± 2) *С в течение 3 ч (при использовании тест-набора Ne 4 — 4 ч).
5.2.2.3 Контрольное определение проводят в соответствии с 5 Z2.1 или 5.2.2.2. В ампулу (микропро-бирку) вносят 0.1 см3 предварительно восстановленного по ГОСТ 23454 препарата СКИв».
Подпункт 5.2.3.1 изложить в новой редакции:
« 5.2.3.1 Ампулы (пластины с микроп роби рками) извлекают из термостата или водяной бани и определяют цвет их содержимого».
Подпункты 5.2.3.2,5.2.3.3. Заменить слова: «ампул» на «ампул (микропробирок)».
Подпункт 5.2.3.3. Исключить слова: «контрольной пробой и».
Пункт 5.3.1. Заменить слова: «тест-набора No 1» на «тест-набора № 6». «по 3.46» на «по 3.48».
Раздел 6 изложить в новой редакции:
«6 Метрологические характеристики
Наименьшие пределы определения антибиотиков в молоке приведены в таблицах 1 и 2.
Таблица1 мг/кг (дм3)
|
Наименование антибиотика |
Наименьший предел определения |
||||
|
Чашечный метод е Bacillus steaio-therm optitas |
Метод с ВасЯив stearoihermopMus я индикатором бромкрезоппурпур |
Метод с Bacillus stearothermophilus я индикатором бриллиантовым черным |
|||
|
Тест-набор N1 1 |
Тест-набор N1 2 |
Тест-набор t* 3 |
|||
|
1 |
2 |
3 |
* |
5 |
в |
|
Амоксицилпин |
— |
0.002 |
0.003 |
0.004 |
0.002 |
|
Ампициллин |
— |
0.002 |
0.003 |
0.004 |
0.002 |
|
Бацитрацин |
— |
0.58 |
1.5 |
— |
— |
|
Бензил пенициллин |
0.005 |
— |
— |
— |
0.002 |
|
Гентамицин |
— |
— |
0.025 |
0.065 |
0.2 |
|
Данофлоксацин |
— |
— |
0.8 |
— |
— |
|
Далсон |
— |
— |
— |
0.03 |
— |
|
Дигидрострелтомицин |
— |
0.7 |
0.2 |
0.8 |
1.0 |
|
Дикпоксадошин |
— |
0.006 |
0.01 |
— |
0.01 |
|
Канамицин |
— |
— |
0.15 |
1.01 |
— |
|
Клоксациллин |
— |
0.012 |
0.015 |
0.006 |
0.02 |
|
Линкомицин |
— |
0.17 |
— |
0.12 |
0.15 |
|
Марбофлоксацин |
— |
— |
0.8 |
— |
— |
|
Мономициин |
0.25 |
— |
— |
— |
— |
|
Нафциллин |
— |
0.004 |
0.005 |
— |
0.01 |
|
Иеомицин |
0.25 |
0.115 |
0.05 |
0.06 |
0.5 |
|
Новобиоцин |
— |
0.75 |
— |
— |
— |
|
Оссацилгмм |
— |
— |
0.01 |
0.03 |
0.01 |
|
Окситеграциклин |
0.1 |
0.3 |
0.1 |
0.1 |
0.5 |
|
Олеандоамцин |
2.5 |
— |
— |
— |
— |
|
Пенициллин G |
— |
0.002 |
0.002 |
0.002 |
— |
|
Пиперациллин |
— |
— |
— |
— |
0.01 |
|
Рифаксиыин |
— |
0.05 |
— |
— |
— |
|
Рифамицин |
— |
— |
0.1 |
0.04 |
— |
|
Спирамицин |
— |
0.28 |
0.6 |
— |
0.4 |
|
Слектиноашцин |
— |
— |
0.2 |
2.01 |
— |
|
Стрептомицин |
0.5 |
0.95 |
0.4 |
0.4 |
— |
|
Сульфадиэзин |
— |
0.065 |
0,025 |
0.04 |
0.5 |
|
Сульфадиметоксин |
— |
— |
0.025 |
0.04 |
0.5 |
|
Сульфаооксин |
— |
0.13 |
— |
— |
— |
|
Сульфаомоксалин |
— |
— |
0.025 |
— |
— |
|
Сульфаааоразин |
— |
— |
0.025 |
— |
— |
|
Сульфаыетазин |
— |
— |
0.1 |
0.135 |
0.5 |
|
Сульфаметоксаэол |
— |
— |
0.025 |
— |
— |
|
Сульфатиаэол |
— |
0.04 |
— |
0.04 |
0.2 |
|
Тетрациклин |
0.1 |
0.32 |
0.1 |
0.07 |
0.2 |
|
Тилмикоэин |
— |
— |
— |
0.06 |
— |
|
Тилозин |
— |
0.035 |
0.04 |
0.035 |
0.025 |
|
Триметолрим |
— |
— |
0.1 |
0.11 |
— |
|
Хлорамфеникол (левомицетин) |
2.5 |
2.5 |
4.1 |
5.0 |
|
|
Хлортегрзциклин |
0.05 |
— |
0.1 |
0.15 |
— |
Окончание таблиим 1
|
Наименование антибиотика |
Наименьший предел определении |
||||
|
Чашечный метод с ВасЯм steaio-tberrnopfirfus |
Метод е ВасИыа stearotherrnophdus ■ индикатором бромереэодпурпур |
Метод с Baciltus stearothemopMus и индикатором бриллиантовый чорным |
|||
|
Тест-на&ор N1 1 |
Тесг-иабор Nt 2 |
Тест -набор № Э |
|||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
S |
в |
|
Цефазолин |
— |
— |
— |
— |
0.01 |
|
Цефалексин |
— |
0.045 |
— |
0.03 |
0.2 |
|
Цефалоииум |
— |
0.006 |
— |
— |
0.01 |
|
Цефапирин |
— |
— |
— |
0.006 |
0.004 |
|
Цефкином |
— |
0.065 |
— |
0.04 |
0.1 |
|
Цефопв разом |
— |
0.03 |
— |
0.04 |
0.025 |
|
Цвфтиофур |
— |
— |
— |
0.02 |
0.05 |
|
Цвфур оксим |
— |
— |
— |
— |
0.2 |
|
Эритромицин |
0.05 |
0.09 |
0.1 |
0.16 |
0.04 |
Таблица2 мг/ит (дм3)
|
Наименование группы |
Наименьший предел определения |
||
|
антибиотиков |
Метод с BaciMus slearoOvermophike и индикатором брокккрезоппурпур |
||
|
Тест-набор № 4 |
Тест-набор Ni S |
||
|
ампулы |
планшеты микро пробирок |
||
|
Пенициллин |
0.004 |
0.004 |
|
|
Тетрациоемовая группа |
0.07 |
0.075 |
0.05 |
|
Стрептомицин |
0.2 |
0.2 |
|
|
Хлорамфеникол (левомицетт) |
4.1 |
3.08 |
3.08 |
(ИУС N9 2 2015 г.)
4
Дата введения в действие на территория» Российской Федерации — 2015—07—01.
