МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ
(МГС)
INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION
(ISC)
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ
СТАНДАРТ
ГОСТ
32012-
2012
МОЛОКО И МОЛОЧНАЯ ПРОДУКЦИЯ
Методы определения содержания спор мезофильных анаэробных микроорганизмов
Издание официальное
Москва
Стенда ртмнформ 2013
ГОСТ 32012—2012
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стан* дартизации установлены ГОСТ 1.0—92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2—2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосу* дарственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН Государственным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт маслоделия и сыроделия» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИМС Россельхозакадемии)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 3 декабря 2012 г. № 54-П)
За принятие проголосовали:
|
Краткое наименование страны по МК <ИСО 3166) 004-97 |
Код страны по МК <ИСО 3166) 004-97 |
Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
|
Беларусь |
BY |
Госстандарт Республики Беларусь |
|
Казахстан |
KZ |
Госстандарт Республики Казахстан |
|
Киргизия |
ко |
Кыргыэстандарт |
|
Молдова |
МО |
Молдова-Стандарт |
|
Россия |
RU |
Росстандарт |
|
Таджикистан |
TJ |
Таджикстандарт |
|
Узбекистан |
UZ |
Уэстандарт |
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 июня 2013 г. № 230-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32012—2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2014 г.
5 Настоящий стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 54075—2010
6 8ВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информацией-номуказателе *Национальныестандарты», а текст изменений илолраеок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
© Сгандартинформ, 2013
В Российской Федерации настоящий стандартне может быть полностью или частично воспроизведен. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии
ГОСТ 32012—2012
Содержание
1 Область применения……………………………………………1
2 Нормативные ссылки…………………………………………..1
3 Термины и определения…………………………………………2
4 Средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы и реактивы…………..3
5 Отбор проб…………………………………………………4
6 Метод определения общего количества спор мезофильных анаэробных бактерий…………4
7 Методопределения количества спор мезофильных лактатсбраживающих анаэробных бактерий . . 7
Приложение А (обязательное) Рост споровых анаэробных бактерий на среде СДА…………9
Приложение Б (обязательное) Рост споровых анаэробных лактатсбраживающих бактерий на среде
ПАССА…………………………………………..10
in
ГОСТ 32012—2012
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
МОЛОКО И МОЛОЧНАЯ ПРОДУКЦИЯ
Методы определения содержания спор мезофилькых анаэробных микроорганизмов
МИК end milk product
Methods for determinabon of the spores content of mesophlltc anaerobic microorganisms
Дата введения— 2014—07—01
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на сырое и подвергнутое термизации или низкотемпературной пастеризации молоко, сыры и другую молочную продукцию и устанавливает методы определения в них содержания общего количества спор мезофильных анаэробных микроорганизмов (бактерий) и спор мезофильных лаюгатсбраживающих анаэробных микроорганизмов (бактерий).
2 Нормативные ссылки
8 настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ ISO 7218—2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям
ГОСТ 199—78 Реактивы. Натрий уксуснокислый 3-водный. Технические условия ГОСТ 490—2006 Кислота молочная пищевая. Технические условия ГОСТ 745—2003 Фольга алюминиевая для упаковки. Технические условия ГОСТ 779—55 Мясо-говядина в попутушах и четвертинах. Технические условия ГОСТ 975—88 Глюкоза кристаллическая гидратная. Технические условия ГОСТ 1770—74 (ИС01042—83. ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры. мензурки, колбы, лробирки. Общие технические условия
ГОСТ 3118—77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 4025—95 Мясорубки бытовые. Технические условия
ГОСТ 4147—74 Реактивы. Железо (III) хлорид 6-водный. Технические условия
ГОСТ 4199—76 Реактивы. Натрий твтраборнокислый 10-водный. Технические условия
ГОСТ 4201—79 Реактивы. Натрий углекислый кислый. Технические условия
ГОСТ 4233—77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия
ГОСТ 4328—77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 5556—81 Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия
ГОСТ 6709—72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 9147—80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия
ГОСТ 9412—93 Марля медицинская. Общие технические условия
ГОСТ 10163—76 Крахмал растворимый. Технические условия
ГОСТ 12026—76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
Издание официальное
1
ГОСТ 32012—2012
ГОСТ 13805—76 Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей. Технические условия
ГОСТ 13928—84 Молоко и сливки заготовляемые. Правила приемки, методы отбора проб и подготовка их к анализу
ГОСТ 14919—83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие тех* нические условия
ГОСТ 17206—96 Агар микробиологический. Технические условия
ГОСТ 18300—87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия
ГОСТ 19881—74 Анализаторы потенциометрические для контроля pH молока и молочных продуктов. Общие технические условия
ГОСТ 23683—89 Парафины нефтяные твердые. Технические условия
ГОСТ 25336—82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 26678—85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия
ГОСТ 26809—86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка пробканализу
ГОСТ 27752—88 Часы электронно-механические кварцевые настольные, настенные и часы-будильники. Общие технические условия
ГОСТ 28498—90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 29169—91 (ИСО 648—77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой
ГОСТ 29227—91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Еслиссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей »ту ссылку.
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены термины, установленные ГОСТ ISO 7218. а также следующие термины с соответствующими определениями:
3.1 общее количество спор мезофильных анаэробных бактерий: Количество микроорганизмов. сохранившихся после тепловой обработки исследуемого продукта или его разведений при температуре (75 ± 1) *С в течение 30 мин. способных прорастать, размножаться и давать видимые признаки роста в анаэробных условиях на соответствующих основных питательных средах при температуре (37±1}®С.
3.2 количество спор мезофильных лактатсбраживающих анаэробных бактерий: Количество микроорганизмов, сохранившихся после тепловой обработки исследуемого материала или его раз-ведений при температуре (75 ± 1) *С в течение 30 мин, способных прорастать, размножаться и давать видимые признаки роста в анаэробных условиях при температуре (37 ± 1) *С на соответствующих дифференциально-диагностических питательных средах, содержащих в качестве источника углеводного питания только лактаты.
3.3 основная питательная среда (общего назначения): Среда, предназначенная для выращивания различных микроорганизмов.
3.4 дифференциально-диагностическая питательная среда: Среда, предназначенная для разграничения отдельных групп (видов) микроорганизмов.
3.5 сухие питательные среды (СДА, ЛАССА и др.): Порошкообразные или гранулированные питательные среды промышленного производства, отвечающие требованиям соответствующих документов. предназначенные для приготовления рабочих питательных сред, а также среды зарубежного производства, имеющие разрешение на их применение.
3.6 рабочая питательная среда: Среда, приготовленная изодноименнойсухойпитательнойсре-ды или отдельных компонентов и подготовленная для выполнения микробиологических посевов.
2
ГОСТ 32012—2012
3.7 полужидкая (полутвердая) питательная среда: Рабочая питательная среда, содержащая микробиологического агара от 0.3 % до 0.8 %.
3.8 рабочая питательная среда СДА: Полужидкая основная питательная среда для определения общего количества спор мезофильных анаэробных бактерий при контроле молока, сыров и другой молочной продукции.
3.9 рабочая питательная среда ЛАССА: Полужидкая дифференциально-диагностическая питательная среда для определения спор лактатсбражиеающих маслянокислых бактерий.
3.10 признак роста: Внешнее изменение питательной среды, свидетельствующее о росте и развитии микроорганизмов.
4 Средства измерений, вспомогательное оборудование,
материалы и реактивы
Анализатор потенциометрический для контроля pH по ГОСТ 19881. диапазоном измерения pH 3—8, погрешностью измерения pH ± 0,02.
Весы лабораторные среднего класса точности, с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0,01 и ±0.1 г.
Термостат жидкостный (редуктазник), позволяющий поддерживать температуру от25 ”С до 55вС,с отклонением от заданной температуры ±°1 вС.
Термостат жидкостный, позволяющий поддерживать температуру от 15 аС до 55 вС, с отклонением от заданной температуры ± 1 *С.
Термостат суховоздушный с естественной или принудительной циркуляцией воздуха, с охлаждением.
Стерилизатор паровой медицинский (автоклав).
Баня водяная с обогревом, позволяющая поддерживать температуру от 0 *С до 100 *С, с отклонением от заданной температуры ± 2 вС.
Мясорубка бытовая по ГОСТ 4025.
Термометр стеклянный жидкостный (нертутный) по ГОСТ 28498. диапазоном измерения от 0 ‘С до 100 *С. ценой деления шкалы 1 *С.
Шкаф сушильный, обеспечивающий поддержание температуры (160 ± 5) *С.
Анаэростаты или другие устройства, создающие анаэробные условия.
Часы по ГОСТ 27752 или таймер.
Плитка электрическая по ГОСТ 14919.
Холодильник бытовой по ГОСТ 26678.
Спиртовка СЛ-1 по ГОСТ 25336.
Пробки резиновые конусные.
Емкости металлические или кастрюли, используемые для растворения, расплавления, нагревания или охлаждения питательных сред и воды.
вспомогательное оборудование для отбора проб: трубка, отборник, шпатель, щуп, ложка, мешалка. нож. пробник.
Фольга алюминиевая по ГОСТ 745.
Вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556.
Бумага индикаторная универсальная.
Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.
Марля медицинская по ГОСТ 9412.
Пипетки 1—1 (2)~1 по ГОСТ 29169.
Пипетки 1~1 (2Н(2И{2.5,25) по ГОСТ 29227.
Колбы мерные 2-50(100,200.500.1000)-2 по ГОСТ 1770.
Колбы конические Кн-2-100(250)-34 ТХС по ГОСТ 25336.
Цилиндры 1 (2}-25{50,100)—1 по ГОСТ 1770.
Пробирки П1. П2-16-150 ТС по ГОСТ 25336.
Пробирки П1. П2-21-200 ТС по ГОСТ 25336.
Стаканчики для взвешивания (бюксы)типое СВ и СН по ГОСТ 25336.
Стекло часовое.
Ступки лабораторные фарфоровые с пестиком по ГОСТ 9147.
Ланцет.
Штатив для пробирок.
ГОСТ 32012—2012
Агар микробиологический по ГОСТ 17206.
Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор объемной долей 20 %.
Кислота молочная по ГОСТ 490. раствор объемной допей 20 %.
Кальций молочнокислый по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328. раствор массовой долей 20 %.
Натрий углекислый кислый по ГОСТ4201. ч. д. а.
Натрий уксуснокислый вводный по ГОСТ 199. ч. д. а.
Натрий хлористый по ГОСТ 4233.
Натрий тетраборнокислый 10-еодный по Г ОСТ 4199, ч. д. а.
Парафин по ГОСТ 23683.
Масло вазелиновое.
Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей поГОСТ 13805.
Гидролизат белков молока по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.
Гидролизат казеина.
Мясо — говядина по ГОСТ 779.
Автолизат дрожжевой сухой ло нормативным документам, действующим на территории государств. принявших стандарт.
Глюкоза кристаллическая гидратная по ГОСТ 975.
Крахмал растворимый по ГОСТ 10163.
Кислота аскорбиновая пищевая по нормативным документам, действующим на территории государств. принявших стандарт.
Цистеин солянокислый по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.
Железо (III) хлорид 6-водный по ГОСТ 4147. ч. д. а.
Индикатор нейтральный красный (нейтральрот) ло нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.
Среда сухая для определения спор мезофильных анаэробных бактерий (СДА) по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.
Среда сухая для определения лактатсбраживающих анаэробных бактерий (ЛАССА) ло нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.
Спирт этиловый ректификованный и спирт этиловый ректификованный технический ло ГОСТ 18300.
Вода питьевая по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт.
Вода дистиллированная поГОСТ 6709.
Допускается применение других средств измерений, реактивов, по качеству и метрологическим характеристикам не уступающих перечисленным выше.
5 Отбор проб
Отбор проб и подготовка их к анализу — по ГОСТ 13928. ГОСТ 26809.
6 Метод определения общего количества спор мезофильных анаэробных бактерий
6.1 Сущность метода
Метод основан на способности спор мезофильных анаэробных микроорганизмов (бактерий), сохранившихся после тепловой обработки исследуемого материала или его разведений при температуре (75 i 1) вС в течение 30 мин, прорастать, размножаться и давать видимые признаки роста в питательных средах.
Метод предназначен для оценки сырого молока и выявления источника микробиологической порчи молочных продуктов.
ГОСТ 32012—2012
6.2 Подготовка к анализу
6.2.1 Приготовление раствора хлористого натрия (физиологический раствор) для приго-товления разведений
8 1 дм3 питьевой воды растворяют 8.5 г хлористого натрия, затем раствор разливают по 10 см3 в чистые стеклянные пробирки диаметром 21 мм. по 93 см3 — в колбы. Емкости закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121 ±2) *С в течение (20 ±5) мин. После стерилизации в про* бирках должно остаться около 9 см3, а в колбах — около 90 см3 раствора хлористого натрия.
6.2.2 Приготовление рабочей питательной среды СДА для определения общего количества спор мезофильных анаэробных бактерий
6.2.2.1 (50 ± 5) г сухой среды СДА вносят в 1 дм3 воды, тщательно перемешивают, нагревают и кипятят 3—5 мин. не допуская лригорания. 6 полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20 %-ным раствором гидроокиси натрия или 20 %-ным раствором молочной или соляной кислоты до значения (7.3 10.1) pH. Готовую среду разливают в пробирки по (12 ± 1) см3, закрывают ватными или ватно-марлевыми пробками и стерилизуют при температуре (121 ±2)*Свтечение(15± 1)мин.
Готовая рабочая питательная среда должна иметь интенсивно красный цвет.
Готовую рабочую питательную среду хранят в холодильнике при температуре (8 ± 2) вС не более 1 мес или при темлературеот 18*Сдо 23 °С не более 7 сутпри условии сохранения внешнего вида среды.
6.2.2.2 Допускается приготовление рабочей питательной среды для определения общего количества спор мезофильных анаэробных бактерий из отдельных ингредиентов. Для этого в 1 дм3 питьевой воды вносят 33.3 г гидролизата белков молока. 15,0 г микробиологического агара. 0,5 г солянокислого цистеина или 1,0 г аскорбиновой кислоты. 1.0 г растворимого крахмала и 5,0 г уксуснокислого натрия. Растворяют добавленные компоненты, нагревая смесь в текучем паре. Добавляют 5.0 г глюкозы и 4.0 г сухого дрожжевого автолизата. Устанавливают pH (7.1 ±0.1). разливают среду в пробирки по (10 ±2)см3, закрывают ватными или ватно-марлевыми пробками и стерилизуют при температуре (121 ±2) *С в теме-ние(15±1)мин.
При длительном хранении рабочей питательной среды (более 20 сут) после охлаждения пробирок со средой в стерильных условиях ватные пробки заменяют на стерильные резиновые пробки.
Рабочую питательную среду хранят в холодильнике при температуре (812) *С не более 1 мес или при температуре от 18 *С до 23 °С не более 7 сут при условии сохранения внешнего вида среды.
6.2.3 Приготовление водного агара
В 1 дм3 питьевой воды вносят 15 г агара и нагревают до кипения. После расплавления агара раствор в горячем состоянии разливают в пробирки по 15 см3 или в колбы по 50—100 см3, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121 ±2) *С в течение (15 ± 1) мин.
6.3 Подготовка образцов к анализу
6.3.1 Подготовка образцов сырого молока и жидкой молочной продукции
Пробы жидкой молочной продукции (сырое молоко, восстановленное молоко и другие, аналогичные по консистенции продукты)тщатвльно перемешивают иотбирают для анализа стерильной пипеткой по 15 см3, переносят в стерильные пробирки, которые закрывают стерильными ватными пробками. При этом необходимо следить, чтобы капельки продукта не попадали на стенки пробирок.
Подготовленные пробирки вместе с контрольной пробиркой, в которой находится 10 см3 раствора хлористого натрия по 6.2.1 или воды и термометр, помещают в водяную баню. Уровень воды в водяной бане должен быть выше уровня продукта на 10—15 мм. Пробирки выдерживают при температуре (75 ± 1) ®С в течение (30±3) мин. затем быстро охлаждают до комнатной температуры, погружая их в холодную воду.
8 зависимости от предполагаемой обсемененности исследуемого жидкого молочного продукта спорами мезофильных анаэробных бактерий из прогретых проб готовят десятикратные разведения в соответствии с требованиями ГОСТ Р 53430.
Допускается приготовление разведений из непрогретых проб продуктов с последующим совместным прогревом проб исходных продуктов и их разведений при температуре (75 г. 1 )*С в течение (30±3)мин.
6.3.2 Подготовка проб сыра и аналогичной по консистенции молочной продукции
8 зависимости от предполагаемой обсемененности исследуемого сыра или иной молочной продукции спорами мезофильных анаэробных бактерий из отобранных проб готовят десятикратные разведения в соответствии с нормативными документами стран, присоединившихся кстандарту.
5
ГОСТ 32012—2012
Подготовленные пробирки с разведениями проб сыра или иной молочной продукции вместе с кон* трольной пробиркой, в которой находятся термометр и 10 см3 раствора хлористого натрия по 6.2.1 или воды, помещают в водяную баню и выдерживают при температуре (75 ± 1) *С в течение (30 ± 3) мин.
6.4 Проведение анализа
6.4.1 Техника посева споровых анаэробных бактерий
Для создания условий развития анаэробных микроорганизмов могут быть использованы следую* щие приемы:
• посев в высокий столбик рабочей питательной среды:
• культивирование посевов в анаэростатах или других устройствах, создающих анаэробные условия:
• применение специальных реагентов для создания анаэробных условий.
6.4.1.1 Посев анаэробных микроорганизмов проводят в пробирки с рабочей питательной средой, разлитой высоким столбиком.
Непосредственно перед посевом для снижения содержания свободного кислорода рабочие пита* тельные среды кипятят в водяной бане в течение 10—20 мин. При кипячении из среды вытесняются газо* образные вещества, в том числе кислород.
Пробирки с прокипяченными рабочими питательными средами быстро охлаждают до (40 ± 1) *С и используют для посева.
Засев рабочей питательной среды проводят соответствующим разведением посевного материала пипеткой. Посевной материал при этом должен свободно вытекать из пипетки без принудительного выдувания.
После проведения посева для уменьшения диффузии кислорода из воздуха рабочие питательные среды сверху заливают стерильным вазелиновым маслом или парафином, или водным агаром толщи* ной слоя (1.5 ± 0.5) см.
При посеве анаэробных микроорганизмов возможно использование анаэробных инкубаторов или настольных анаэробных систем с газогенераторными пакетами.
6.4.2 Посев и культивирование
Для определения количества спор меэофильных анаэробных бактерий проводят посев 1 см3 под* готовленной пробы (для молока — нулевое, первое и второе, для сыра — первое и второе разведения; для других молочных продуктов — в зависимости от предполагаемого уровня обсемененности) в про* бирку с 10—12 см3 рабочей питательной среды, приготовленной по 6.2.2 или 6.2.3. выдержанной перед анализом в кипящей водяной бане в течение 30 мин и охлажденной до температуры (40 ± 1 )*С.
Каждое из выбранных разведений исследуемого продукта засевают в две пробирки с рабочей питательной средой, внося посевной материал на дно пробирки, не допуская взбалтывания среды и не выдувая посевной материал.
Сверху посевы заливают слоем вазелинового масла или парафина, или водного агара по 6.2.3, предварительно расплавленного до температуры (45 ± 1) вС. Высота слоя должна быть не менее (1.5±0,5)см.
При использовании для посева пробирок с рабочей питательной средой, разлитой высоким стол* биком. допускается не заливать посевы защитным слоем вазелинового масла или парафина, или водного агара.
Пробирки с посевом помещают в термостат при температуре (37 ± 1) “С на 72 ч.
6.5 Обработка результатов
Наличие спор мезофильных анаэробных бактерий в засеянных объемах исследуемого продукта определяют по изменению окраски среды с красной на желтую и газообразованию (появлению разрывов агарового столбика).
В посевах без защитного слоя рост мезофильных анаэробных бактерий определяют по пенообра* зованию. образованию «карманов» в столбике рабочей питательной среды и изменению цвета рабочей питательной среды с красного на желтый. Вданном случае основным признаком роста является изменение окраски, так как процесс газообразования может быть не зафиксирован.
Наиболее вероятноечисло(НВЧ)слор мезофильных анаэробных бактерий при анализе определяют по числу пробирок, в которых они дали рост согласно таблице 1.
6
ГОСТ 32012—2012
Таблица 1
|
Чиспо пробирок с положительными результатами при посева» |
Наиболее вероятное чиспо спор о 1 см3 |
Чиспо пробирок с положительными результатами при посевах |
Нвибопее вероятное чиспо спор о 1 см3 |
||||
|
1 см3 |
0,1 см3 |
0.01 смэ |
1 см3 |
0,1 см3 |
0.01 см3 |
||
|
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
1 |
2 |
|
|
0 |
0 |
1 |
0.S |
1 |
2 |
0 |
2.0 |
|
0 |
0 |
2 |
— |
1 |
2 |
1 |
3.0 |
|
0 |
1 |
0 |
0.S |
1 |
2 |
2 |
— |
|
0 |
1 |
1 |
0.9 |
2 |
0 |
0 |
2.5 |
|
0 |
1 |
2 |
— |
2 |
0 |
1 |
S.0 |
|
0 |
2 |
0 |
0.9 |
2 |
0 |
2 |
— |
|
0 |
2 |
1 |
— |
2 |
1 |
0 |
6.0 |
|
0 |
2 |
2 |
2 |
1 |
1 |
13.0 |
|
|
1 |
0 |
0 |
0.6 |
2 |
1 |
2 |
20.0 |
|
1 |
0 |
1 |
1.2 |
2 |
2 |
0 |
25.0 |
|
1 |
0 |
2 |
— |
2 |
2 |
1 |
70.0 |
|
1 |
1 |
0 |
1.3 |
2 |
2 |
2 |
110.0 |
|
1 |
1 |
1 |
2.0 |
— |
— |
— |
Более 110.0 |
Результаты, в которых количество пробирок с видными признаками роста мезофильных анаэроб* ных бактерий при посевах 1:0,1 и 0,01 см3 молока илисыра соответственно равно 002,012.021.022,102. 112,122, не могут быть использованы для расчета, так как в 95% случаев они вызваны несовершенной техникой приготовления разведений или присутствием антибактериальных веществ. В данныхслучаях исследования повторяют.
Признаки роста споровых анаэробных бактерий на среде СДА представлены в приложении А.
7 Метод определения количества спор мезофильных лактатсбраживающих анаэробных бактерий
7.1 Сущность метода
Метод основан на способности спор мезофильных анаэробных лактатсбраживающих микроорганизмов (бактерий), сохранившихся после тепловой обработки исследуемого материала или его разведений при температуре (75 ± 1) *С в течение 30 мин. прорастать, размножаться и давать видимые признаки роста в соответствующих дифференциально-диагностических питательных средах.
Метод предназначен для оценки сыролригодности сырого молока или выявления источника микробиологической порчи молочной продукции, в том числе сыров.
7.2 Подготовка к анализу
7.2.1 Растворы хлористого натрия и водного агара готовят по 6.2.1,6.2.3.
7.2.2 Приготовление мясопептонного бульона
Говяжье мясо, освобожденное от жира и сухожилий, пропускают через мясорубку, взвешивают, складывают в кастрюлю; заливают двойным количеством питьевой воды, отмечают первоначальный объем и оставляют на 18—24 ч при температуре (5 ± 1) *С. После этого для ускорения процесса экстракции питательных веществ из мяса содержимое кастрюли подогревают до температуры (50 1 5) *С. выдерживают в течение 60 мин и затем кипятят 30—40 мин. После кипячения бульон в горячем состоянии фильтруют через двойной бумажный фильтр. Фильтрат доводят питьевой водой до первоначального объема, добавляют к нему (1.0 ±0,1) % бактериологического пептона и (0.5 ±0.1) % хлористого натрия и устанавливают с помощью раствора гидроокиси натрия массовой долей 20 % активную кислотность (7,310.1) pH. Подготовленный бульон стерилизуют при температуре (121 ±2) *С в течение (15 ± 1) мин.
7
ГОСТ 32012—2012
7.2.3 Приготовление рабочей питательной среды ЛАССА для определения количества спор мезофильных анаэробных лактатсбраживающих бактерий
7.2.3.1 (50 ±5)гсухой среды ЛАССАвносят в 1дм3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают. нагревают и кипятят 3-5 мин. не допуская пригорания. В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20—30 %-ным раствором гидроокиси натрия или 20 %-ным раствором молочной кислоты до значения (5,7 ± 0.1). Полученную рабочую питательную среду разливают в пробирки по (12 ± 1) см3, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121 ±2) *С в течение (15 ± 1) мин.
7.2.3.2 Допускается приготовление рабочей питательной среды для определения количества спор меэофильных анаэробных лактатсбраживающих бактерий из отдельных ингредиентов.
Для этого к 900 см3 мясопелтонного бульона, приготовленного по 7.2.2. добавляют 5.0 г молочнокисл wo кальция, 5,0 гуксуснокислого натрия. 0.8 гсолянокислого цистеина или 1 .Ог аскорбиновой кислоты. 4.0 г сухого дрожжевого автолиза та и 20.0 г агара.
Смесь нагревают до температуры (9512) *С. выдерживают при постоянном помешивании до расплавления агара и добавляют 10 см3 0.01 %-ного раствора треххлористого железа. 10 см3 0.01 %-ного раствора тетраборнокислого натрия. 10 см3 1 %-ного раствора кислого углекислого натрия и 1 см3 0.4 %-ного раствора индикатора нейтрального красного. С помощью раствора 20%-ной молочной кислоты доводят активную кислотность до (5.70 ± 0,05) pH. Приготовленную смесь разливают в пробирки по 10—12 см3, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121 ± 2) вС в течение (15 ± 1) мин. Затем в стерильных условиях ватные пробки заменяют на стерильные резиновые.
Готовая рабочая питательная среда должна иметь интенсивный малиново-красный цвет.
Допускается замена мясопептонного бульона гидролизатом казеина и пептоном. Для этого к 1 дм3 гидролизата казеина добавляют 10 г пептона, устанавливают pH (7,0 ±0,1), нагревают до кипения, фильтруют через бумажный фильтр в чистые колбы и стерилизуют при температуре (121 ±2) *С в тече-ние(15±1)мин.
7.3 Проведение анализа
7.3.1 Подготовку образцов проводят лоб.З.
7.3.2 Посевобразцов проводят поб.4.1 и 6.4.2. используя рабочую питательную среду дляопреде-ления лактатсбраживающих анаэробных бактерий.
Культивирование посевов проводят в термостате при температуре (37 ± 1) *С в течение 72 ч.
7.4 Обработка результатов
7.4.1 Рост мезофильных лактатсбраживающих анаэробных слорообразующих бактерий в посевах определяют по изменению цвета рабочей питательной среды с малиново-красного до соломенно-желтого и газообразованию (образованию разрывов столбика агара).
7.4.2 Определение наиболее вероятного числа спор мезофильных лактатсбраживающих анаэробных бактерий проводят по 6.5.
Признаки роста слоровых анаэробных лактатсбраживающих бактерий на среде ЛАССА представлены в приложении Б.
8
Приложение А (обязательное)
ГОСТ 32012
Рост споровых анаэробных бактерий на среде СДА
А.1 Признаки роста споровых анаэробных бактерий представлены на рисунке А.1.
РисунокА.1
ГОСТ 32012—2012
Приложение Б (обязательное)
Рост споровых анаэробных лактатсбраживающих бактерий на среде ЛАОСА
Б.1 Признаки роста слороеых анаэробных бактерий представлены на рисунке Б.1.
Рисунок Б.1
10
ГОСТ 32012—2012
УДК 576.8:006.354 МКС67.100.10
Ключевые слова: молоко, сыр. молочные продукты, методы микробиологического анализа, мезофиль* ные анаэробные и мезофильные лактатсбражиеающие анаэробные микроорганизмы
и
Редактор U.И. Ыоксииова Технический редактор В.Н. Прусакова Корректор ЕЛ- Дупьнеоа Компьютерная верстка Ю.В.Дамаминой
Сдано а набор 29.10.2013. Подписано в печать II.11.2013. Формат 60-64£ Гарнитура Ариел. Уел. печ. л. 1,66. Уч.-иэд. л. 1.45. Тираж 143 экэ Зак. 1322.
. 123995 Москва. Гранатный пер.. 4
Набрано во ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ* на ПЭВМ.
Отпечатано а филиале — тип. «Московский печатник», 105062 Москва. Ляпин пер., б.
